pCMV-MCS-P2A-EGFP-HA-Neo(pCMV-MCS-P2A-EGFP-HA-Neo质粒)(D2640-1μg)

pCMV-MCS-P2A-EGFP-HA-Neo是碧云天研发的用于在哺乳动物细胞中同时表达目的蛋白、增强绿色荧光蛋白EGFP和新霉素(Neomycin)抗性基因的表达质粒。 本质粒含有的CMV启动子可以高效启动目的基因的表达，同时可以通过P2A共表达增强绿色荧光蛋白EGFP，便于通过EGFP的荧光特性监测目的蛋白的表达情况。本质粒的表达效果可以参考图1。 图1. 碧云天pCMV-MCS-P2A-EGFP-HA-Neo质粒使用Lipo8000™转染试剂(C0533)转染293T细胞后的表达效果图。左侧为明场照片，右侧为荧光照片。本图仅供参考，实际拍摄效果会因具体实验条件的不同而有所不同。 本质粒在多克隆位点和EGFP的编码序列之间含有P2A肽序列。P2A是一个可以被理解为含有19个氨基酸残基(ATNFSLLKQAGDVEENPGP)的“自剪切”小肽。但实际的过程并不是发生自剪切，而是使核糖体跳过P2A等2A元件C端的甘氨酸和脯氨酸肽键的合成而发挥作用，最终导致2A序列末端和下游产物分离。上游目的基因表达蛋白的C端将会添加一些额外的P2A残基(GSGATNFSLLKQAGDVEENPG)，而下游蛋白的N端将会有额外的脯氨酸。在P2A肽的N端加入GSG序列，可提高剪切效率 [1,2]。 本质粒为卡那霉素(Kanamycin)和新霉素(Neomycin)抗性。可利用其卡那霉素抗性，转化大肠杆菌后筛选阳性克隆。转染哺乳动物细胞后，可使用G-418 (ST081/ST082)筛选稳定表达目的蛋白的细胞株。 pCMV-MCS-P2A-EGFP-HA-Neo质粒的主要信息如下： Feature Nucleotide Position CMV enhancer 67-370 CMV promoter 371–574 T3 promoter 620–638 P2A 744-800 EGFP 801-1517 HA 1524-1550 T7 promote 1605-1623 SV40 poly(A) signal 1897-2018 f1 ori 2025-2478 AmpR promoter 2505-2609 SV40 promoter 2611-2968 SV40 ori 2819-2954 NeoR/KanR 3003-3797 HSV TK poly(A) signal 4029-4076 ori 4405-4993 pCMV-MCS-P2A-EGFP-HA-Neo质粒(5101bp)的图谱如下： pCMV-MCS-P2A-EGFP-HA-Neo的多克隆位点的详细图谱如下：https://www.beyotime.com/Manual/D2640 pCMV-MCS-P2A-EGFP-HA-Neo.pdf。 pCMV-MCS-P2A-EGFP-HA-Neo中没有的酶切位点包括： AarI AbsI AccIII Acc113I AccB7I AclI AcvI AfeI AgeI AhdI AhlI Aor13HI Aor51HI AscI AsiGI AsiSI Asp700I AspEI BaeI BbrPI BbsI BbvCI BcuI BlpI BmcAI BmeRI BoxI BpiI Bpu1102I BpuAI BseAI BsePI BshTI BsiWI Bsp13I Bsp68I Bsp1720I BspEI BspQI BssHII BssNAI Bst6I Bst1107I BstEII BstENI BstPI BstPAI BstV2I BstZ17I BtuMI CelII CspAI DriI Eam1104I Eam1105I EarI Eco47III Eco72I Eco91I EcoNI EcoO65I FseI FspAI I-CeuI I-PpoI I-SceI Kpn2I Ksp632I LguI MauBI MreI MroI MroXI MssI NruI PalAI PauI PciSI PdmI Pfl23II PflMI PI-PspI PI-SceI PinAI PmaCI PmeI PmlI PpuMI PshAI Psp5II Psp1406I PspCI PspEI PspLI PspPPI PspXI PsrI RgaI RigI SanDI SapI SbfI ScaI SdaI SfaAI SgfI SgrAI SgrDI SgsI SmiI SpeI Sse8387I SwaI Van91I XagI XcmI XmnI ZrmI pCMV-MCS-P2A-EGFP-HA-Neo中的单酶切位点包括： AccI GT`MK,AC 718 MluI A`CGCG,T 2019 AflII C`TTAA,G 1549 MscI TGG|CCA 3213 ApaI G,GGCC`C 1558 NarI GG`CG,CC 3131 ApaLI G`TGCA,C 4735 NdeI CA`TA,TG 240 BamHI G`GATC,C 687 NheI G`CTAG,C 597 BcgI ,NN`(N)10CGANNNNNNTGC(N)10,NN` 891 NotI GC`GGCC,GC 668 BclI T`GATC,A 1790 PaeR7I C`TCGA,G 729 BglII A`GATC,T 723 PciI A`CATG,T 5049 BmgBI CAC|GTC 779 PflFI GACN`N,NGTC 3249 BmtI G,CTAG`C 601 PluTI G,GCGC`C 3134 BsaI GGTCTCN`NNNN, 4120 PspOMI G`GGCC,C 1554 BsaXI ,NNN`(N)9ACNNNNNCTCC(N)7,NNN` 2183 PstI C,TGCA`G 703 BsmBI CGTCTCN`NNNN, 769 PvuI CG,AT`CG 1636 BspDI AT`CG,AT 2971 RsrII CG`GWC,CG 3647 BsrDI GCAATG,NN` 3364 SacI G,AGCT`C 655 BsrGI T`GTAC,A 1510 SacII CC,GC`GG 662 BstBI TT`CG,AA 3813 SalI G`TCGA,C 717 BstXI CCAN,NNNN`NTGG 663 SfiI GGCCN,NNN`NGGCC 2906 ClaI AT`CG,AT 2971 SfoI GGC|GCC 3132 CspCI ,NN`(N)11CAANNNNNGTGG(N)10,NN` 382 SmaI CCC|GGG 682 DraIII CAC,NNN`GTG 2249 SnaBI TAC|GTA 346 Eco53kI GAG|CTC 653 SrfI GCCC|GGGC 682 EcoRI G`AATT,C 705 StuI AGG|CCT 2952 EcoRV GAT|ATC 713 TspMI C`CCGG,G 680 Esp3I CGTCTCN`NNNN, 769 Tth111I GACN`N,NGTC 3249 HindIII A`AGCT,T 693 XbaI T`CTAG,A 1518 HpaI GTT|AAC 1896 XhoI C`TCGA,G 729 KasI G`GCGC,C 3130 XmaI C`CCGG,G 680 MfeI C`AATT,G 1883